جداسازی و همسانه سازی ژن defensin (dna ژنومی و cdna) از منابع گیاهی

یکی از مهمترین عوامل کاهش محصولات کشاورزی، آسیب های ناشی از حمله قارچ های پاتوژن به گیاهان زراعی است. غشاء پلاسمایی قارچ، هدف بزرگترین گروه پروتئین های ضدقارچی می باشد. بیش از 500 پروتئین طبیعی که با غشاء قارچ برهمکنش می کنند گزارش شده است. این پروتئین ها منجر به شکل گیری منفذ، جریان ترکیبات سلولی به سمت خارج و در نتیجه تغییر در پتانسیل غشاء می شوند. یکی از مهمترین پروتئین ها، defensin ها می باشند که با اثر بر روی کانال های یونی غشاء پلاسمایی قارچ های پاتوژن باعث مختل شدن جریان های یونی شده و به دنبال آن تغییر در پتانسیل غشاء و نهایتاً مرگ سلول قارچ را منجر می شوند. در این تحقیق شناسایی، کلون کردن و تعیین توالی ژن rs-afp1 از گیاه تربچه (raphanus sativus) و ژن tfgd2 از گیاه شنبلیله (trigonella foenum-graecum)صورت گرفت. در ابتدا استخراج dna ژنومی به روش ctab انجام و برای تکثیر این ژن ها از آغازگرهای اختصاصی rdeff و rdefr برای تکثیر ژن گیاه تربچه و آغازگرهای اختصاصی mdeff و mdefr برای تکثیر ژن گیاه شنبلیله استفاده گردید. قطعات مورد انتظار به طول تقریبی ??6 جفت باز مربوط به گیاه تربچه و 7?? جفت باز مربوط به گیاه شنبلیله تکثیر و در وکتور pjet1.2 کلون گردیدند. در مرحله بعد محصول بدست آمده با استفاده از الگوهای هضم آنزیمی و pcr تا?یید و به نام pjetme1 (وکتور نوترکیب حاوی ژن تربچه) و pjetme3 (وکتور نوترکیب حاوی ژن شنبلیله) نامگذاری شدند. همچنین cdna های ژن های مذکور پس از استخراج rna های مربوطه، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی سنتز گردید. cdna های حاصله به طول تقریبی 243 جفت باز مربوط به گیاه تربچه و 219 جفت باز مربوط به گیاه شنبلیله با الگوی هضم آنزیمی و الگوی pcr تا?یید و در وکتور pjet1.2 کلون شده و پلاسمیدهای حاصله به نام pjetme2 (پلاسمید نوترکیب حاوی cdna تربچه) و pjetme4 (پلاسمید نوترکیب حاوی cdna شنبلیله) نامگذاری شده و جهت تعیین توالی مورد استفاده قرار گرفتند. مقایسه توالی dna ژنومی و cdna این ژن ها نشان داد که ژن rs-afp1 گیاه تربچه حاوی یک اینترون به طول 11? جفت باز و open reading frame آن پپتیدی به طول 80 اسیدآمینه ( kda7/8) را کد می کند و ژن tfgd2 گیاه شنبلیله حاوی یک اینترون به طول 486 جفت باز و orf آن پپتیدی به طول 72 اسید آمینه (kda 2/8) را کد می کند. مقایسه توالی اسیدآمینه ای بدست آمده از ژن rs-afp1 از گیاه تربچه با توالی های ثبت شده در بانک ژنی نشان داد که این پپتید با پپتید مشابه از گیاهان brassica juncea ، orychophragmus violaceus ، brassica oleracea ، sinapis alba، arabidopsis halleri ، eutrema wasabi وbrassica rapa به ترتیب 8/98، 2/96 ، 8/93، 5/92، 2/91، 90 و 90 درصد تشابه را نشان میدهد. همچنین در مقایسه توالی اسیدآمینه ای بدست آمده از ژن tfgd2 از گیاه شنبلیله با توالی های ثبت شده در بانک ژنی نشان داد که این پپتید با پپتید مشابه از گیاهانcajanus cajan ، cicer arietinum ، medicago sativa و medicago truncatula به ترتیب 100، 100، 6/98 و 6/98 درصد تشابه را نشان می دهد.